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"Microwave Enhanced Enzymatic Digestion", J. Collins


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Produktflyer Enzymatischer Aufschluss (PDF)


Anwendungen der Mikrowelle beim enzymatischen Aufschluss (PDF)

Microwave Assisted Deglycosylation of Antibodies for Accurate Molecular Weight Determination (PDF)

Microwave-Assisted Nonreductive Rellease of o-linked Glycans: A Method with Numerous Advantages (PDF)

Development of a Robust and High Throughput Method for Profiling N-Linked Glycans Derived from Plasma Glycoproteins by NanoLC-FTICR Mass Sprectrometry (pdf)

Applikation:
In-Gel Microwave Enzymatic (Trypsin) Digestion (pdf)

Enzymatischer Aufschluß

Mikrowellenunterstützter Enzymatischer Aufschluss

Der enzymatische Aufschluss ist ein wichtiger Schritt in der Probenvorbereitung zur Sequenzanalyse von Proteinen. Dieser Arbeitsschritt beinhaltet das selektive enzymunterstützte Zersetzen von Proteinen in kleinere Peptide nach bestimmten Aminosäurebindungen. Hierbei kommt dem Enzym Trypsin eine wichtige Bedeutung zu, da es die Aminosäurekette nach Lysin und Arginin aufspaltet. Komplexe Software-Programme analysieren diese Peptidfragmente und geben dadurch Auskunft über die ursprünglichen Aminosäuresequenzen des Proteins. Die Präzision und Aussagekraft dieser Softwareergebnisse hängt somit wesentlich von der Effizienz des Trypsin-Aufschlusses und den dadurch enthaltenen Peptidfragmenten ab.

Der klassische enzymatische Aufschluss wird typischerweise bei 37 °C Aufschlusstemperatur durchgeführt und dauert von 8 bis 24 Stunden. Sehr häufig ist der Aufschluss nicht komplett und somit kann nicht das gesamte Protein identifiziert werden. Speziell die hydrophoben Proteine lassen sich vom Trypsin nur unzureichend aufspalten.

Dieser hohen Zeitintensität steht der Bedarf an einem hohen Probendurchsatz gegenüber. Deshalb werden Trypsin-Aufschlüsse häufig in 96 Well Platten durchgeführt. Mit der Mikrowelle werden die Trypsin-Aufschlüsse enorm beschleunigt und die Aufschlußqualität wird wesentlich verbessert. Allerdings ist der Einsatz von 96 Well Platten in Mikrowellen-Laborgeräten ein schwieriges Unterfangen, da die einzelnen Positionen auf der 96 Well Platte in Multi-Mode Mikrowellengeräten sehr unterschiedlich die Mikrowelle einkoppeln. Unterschiedliche Lösungsansätze mit Mikrowellenabsorbern wie z.B. graphitdotiertem Teflon® oder SiC Keramik führten in der Praxis ebenfalls nicht zu befriedigenden Lösungen, um die unterschiedliche Temperaturentwicklung in den einzelnen Positionen zu regulieren.



Schneller Enzymatischer Verdau und Proteinhydrolyse in der Discover Mikrowelle
In Mono-Mode-Mikrowellensystemen ist aufgrund der gleichmäßigen Mikrowellenverteilung ein gleichmäßiges Einkoppeln in nebeneinander angeordnete Poitiosnen zu beobachten, allerdings passen die 96 Well Platten nicht in eine Mono-Mode-Mikrowellenkammer. Somit entwickelte CEM einen speziellen Probenhalter für 14 Eppendorf Gefäße, die im Discover eingesetzt werden können und die gleichmäßig Mikrowelle adsorbieren.



Spezieller Probenhalter für 14 Eppendorf Gefäße




Die gleichmäßige Mikrowelleneinkoppelung sorgt für eine gleichmäßige
Temperaturentwicklung bei den 8 eingesetzten Eppendorf Gefäßen



Warum wirkt die Mikrowelle auf den enzymatischen Aufschluss?

Jede Peptid-Bindung verfügt über ein starkes Dipolmoment, welche von der Mikrowellenstrahlung gezielt aktiviert wird. In der Peptid-Synthese wird diese molekulare Eigenschaft genutzt, um schwierige Sequenzen und lange Aminosäureketten darzustellen, die klassisch kaum möglich sind. Man nimmt an, das die Kettenaggregation infolge von Mikrowelleneinwirkung abnimmt und die Aminosäureketten gestreckt werden, also für die Addition weiterer Aminosäuren zugänglich werden. Dasselbe Prinzip der Streckung der Aminosäuren macht man sich beim enzymatischen Aufschluss zu Nutzen. Die Bindungen zwischen den einzelnen Aminosäuren werden für den Angriff des Trypsins zugänglich.



Für die Wirkungsweise der Proteine ist ihre räumliche Struktur (ihre Faltung) besonders wichtig. Die Proteinstruktur lässt sich auf vier Betrachtungsebenen beschreiben: Die Primärstruktur, die Sekundärstruktur, die Tertiärstruktur sowie die Quartärstruktur. Für die Betrachtung des Einflusses der Mikrowelle ist speziell die Sekundärstruktur von Interesse. Als Sekundärstruktur wird die räumliche Anordnung der Aminosäuren eines Proteins bezeichnet. Man unterscheidet dabei zwischen folgenden Strukturtypen: Alpha-Helix, Beta-Faltblatt, Beta-Turn und ungeordnete, so genannte Random-Coil-Strukturen. Diese Strukturen ergeben sich durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Peptidbindungen des Polypeptid-Rückgrates. Die Helixstruktur stellt eine Spiralisierung des Proteins dar, ähnlich dem Aufbau der Doppelstrang DNA. Diese Spirale maximiert die einelnen Dipole der Aminosäurebindungen zu einem großen Dipolmoment über die gesamte Helixstruktur, was wiederum zu großen Wechselwirkungen mit dem oszilierenden Mikrowellenfeld führt.



Die folgende Tabelle zeigt einen Vergleich der Dipolmomente:

Molekül: Dipolmoment (Debye)
Wasser: 1,8
Peptid Bindung: 2,5
Myoglobin: 170
Horse Serum Albumin: 380
Horse Carboxy Haemoglobin: 480

Comparative dipole moments -From R. Pethig, in “Protein-Solvent Interactions" R. B. Gregory Ed., Marcel Dekker, New York, 1994.


Unterschiedliche Untersuchungen von diversen enzymatischen Aufschlüssen zeigen deutliche Effekte im Mikrowellenfeld, speziell bei der Aufschlussqualität und den daraus resultierenden Erkenntnissen.



Hier ist ein Ausschnitt der aktuellen Arbeiten:

2002
Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes BY Birendra N. Pramanik, Urooj A. Mirza, Yao Hain Ing, Yan-Hui Liu, Peter L. Bartner, Patricia C. Weber and Ajay K. Bose, Schering-Plough Research Institute, Kenilworth, NJ 07033, USA, and George Barasch Bioorganic Research Laboratory, Department of Chemistry and Chemical Biology, Stevens Institute of Technology, Hoboken, NJ 07030, USA. Protein Science 2002, 11, 2676-2687.

2004
High Throughput Protein Identifications Utilizing Microwave Protein Digests and Off-Line Nano-Spray Chip Technology by Jennifer L. Rutherford, Joe Bonapace, Mai-Loan Nguyen, Tonya Pekar and John Pirro, Charles River Proteomic Services, Worcester, MA, USA. Poster Presentation at ASMS Conference on Mass Spectrometry, Nashville, TN 2004.

Analysis of Microwave-assisted Enzymatic Digests of Hemoglobin by Mass Spectrometry by Luchuan Mi, Hubert W. Vesper, Maria Ospina and Gary L. Myers, Protein Biomarker Laboratory, Division of Laboratory Sciences, National Center for Environmental Health, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, Georgia, USA. Poster Presentation at ASMS Conference on Mass Spectrometry, Nashville, TN 2004.

2005
Microwave-Assisted Enzyme-Catalyzed Reactions in Various Solvent Systems by Shan-Shan Lin, Chi-Hong Wu, Mei-Chuan Sun, Chung-Ming Sun and Yen-Peng Ho, Department of Chemistry, National Dong Hwa University, Hualien, Taiwan.J . Am. Soc. Mass Spectrom 2005, 16, 581-588.

Higher-throughput Cleavable ICAT Analysis using Microwave Technology by Tonya M. Pekar, Mai-Loan Nguyen, Jennifer Rutherford, David Innamorati, Joe Bonapace and John Pirro, Charles River Proteomic Services, Worcester, MA, USA. Poster Presentation, Charles River Proteomic Services 2005.

Assessment of microwave-assisted enzymatic digestion by measuring glycated hemoglobin A1c by mass spectrometry by Hubert W. Vesper*, Luchuan Mi, Archibold Enada and Gary Myers, Division of Laboratory Sciences, National Center for Environmental Health, Centers for Disease Control and Prevention, 4770 Buford Highway, NE (MS-F25), USA. Rapid Communications in Mass Spectrometry 2005, 19, 2865-2870.

2006
Microwave-assisted Protein Preparation and Enzymatic Digestion in Proteomics by Wei Sun, Shijuan Gao, Linjie Wang, Yong Chen, Shuzhen Wu, Xiaorong Wang, Dexian Zheng and Youhe Gao, Proteomics Research Center and National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Peking Union Medical College/Chinese Acadamy of Medical Sciences, Beijing 100005, China. Mol. Cell. Proteomics 2006, 5, 769-776.

Microwave Assisted Deglycosylation of Antibodies for Accurate Molecular Weight Determination by Jennie Lill, Wendy Sandoval, Helga Raab, Fred Arellano, Richard Vandlen and David Arnott, Protein Chemistry Deaprtment, Genentech Inc., South San Francisco, CA 94080, USA. Poster Presentation at the 54th ASMS Conference on Mass Spectrometry, Seattle, WA 2006.

Vorteile des enzymatischen Aufschlusses in der Discover Mikrowelle
- Höhere Aufschlussqualität, speziell bei hydrophoben Proteinen
- Schneller Aufschluss in 10 min. im Vergleich zur klassischen
- Arbeitsweise mit Zeiten von vielen Stunden
- Durchsatz: Aufschluss von 14 Proben alle 10 min.
- Einsatz von Standard 1.5 mL Eppendorf Gefäßen mit Verschlusskappe
- Aufschluss in Lösung oder in Gel möglich


Mikrowellenunterstützter enzymatischer Verdau
Der enzymatische Verdau ist ein wichtiger Schritt in der Probenvorbereitung zur Sequenzanalyse von Proteinen und Peptiden mittels Massenspektrometrie. Dabei werden die Proteine oder Peptide durch verschiedene selektive Enzyme (z. B. Glu-C) an bestimmten Schnittstellen gespalten und ein grosses Polymer dabei in einige kleinere Fragmente geschnitten, die sich deutlich leichter sequenzieren lassen. Auch dieser Prozess wird durch Einsatz der Mikrowelle deutlich beschleunigt [Microwave-Assisted Enzyme-Catalyzed Reactions in Various Solvent Systems by Shan-Shan Lin, Chi-Hong Wu, Mei-Chuan Sun, Chung-Ming Sun and Yen-Peng Ho, Department of Chemistry, National Dong Hwa University, Hualien, Taiwan.J . Am. Soc. Mass Spectrom 2005, 16, 581-588.].

Ein klassisches Beispiel ist der Transferrin-Verdau. Der konventionelle Verdau dauert je nach Qualität des schneidenden Enzyms bis zu16 Stunden. Der Verdau mit Mikrowellenunterstützung im Discover dauert demgegenüber nur 10 min. Zudem sind in Mikrowelle Schnitte realisierbar, die konventionell praktisch gar nicht stattfinden, so dass z.B. beim Transferrin-Verdau die Qualität des mikrowellenunterstützen Verdaus um 10% besser ist als auf dem konventionellem Wege [Jennifer Rutherford, Joe Bonapace, Mai-Loan Ngyen, Tonya Pekar, and John Pirro of Charles River Proteomic Services, Worcester, MA. High Throughput Protein Identifications Utilizing Microwave Protein Digests and Off-line Nano-spray Chip Technology (Poster Presentation) Oct 8, 2004].

Anwendungsbeispiel
MALDI-TOF Analyse Transferrin Aufschluss




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